人生就是博-尊龙凯时，为生物医疗领域提供高品质服务。本文将详细介绍RNA模板的制备方法，包括传统的酚CHCl₃抽提法和柱式抽提法。以下是具体操作流程及相关注意事项。

一、RNA模板的制备

1. RNA提取方法

常见的RNA提取方法包括传统的酚CHCl₃抽提法和柱式抽提法。以下以Vazyme产品RNAisolater Total RNA Extraction Reagent (Vazyme#R401)为例，介绍酚CHCl₃抽提法的操作流程。

2. 操作流程概要

自备材料包括CHCl₃、异丙醇、75%乙醇（使用DEPC水配置）及DEPC水。

样本制备

在进行样本制备时，需注意过多的样本量可能导致样本裂解不充分，从而降低产物纯度。1ml RNAisolater的最大样本量如下：

• 贴壁细胞：弃去培养液后，用PBS洗涤一次。对于贴壁牢固的细胞，可以使用细胞刮刀剥离细胞。
• 每10cm²培养面积的细胞需加入1-3ml RNAisolater，使其充分覆盖细胞表面，然后用移液器将细胞吹打下来。
• 将裂解液转移至15ml离心管中，并用移液器反复吹打，直至无明显颗粒存在。冰上静置5分钟。

对于悬浮细胞，操作步骤如下：

• 收集细胞后用PBS洗涤一次。每5×10⁶-10⁷个细胞加入1ml RNAisolater，并反复吹打至无颗粒。
• 冰上静置5分钟。

动物组织的处理

液氮研磨（注意，研磨不彻底会影响RNA的得率和质量）：将液氮研磨的粉末立即转移至离心管中，加入RNAisolater裂解液，静置，待样品完全融化后，再继续吹打至裂解液透明。

然后将裂解液转移至离心管中，12,000×g在4℃条件下离心5分钟，吸取上清液。

匀浆处理

可将新鲜组织剪碎，浸泡在RNAisolater裂解液中，使用电动匀浆器高速匀浆，直到组织完全均匀。随后再次进行离心处理，吸取上清液。

3. 柱式抽提法

以Vazyme产品FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation Mini Kit (Vazyme#RC101/RC111)为例，所需材料包括β-巯基乙醇、无水乙醇及RNase-free枪头等。

对于贴壁细胞，可以直接使用Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇）进行处理，或使用胰酶消化后收集细胞加入Buffer RL1，具体操作为每2-5×10⁶个细胞加入500μl Buffer RL1，并混匀直至看不到细胞团块。

悬浮细胞的处理则为直接离心收集，添加Buffer RL1并混匀，操作完成后可在-70℃保存以备后续使用。

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