细胞冻存是一种在低温条件下保存细胞的方法，旨在长时间保持细胞的活性和功能。这种方法对于细胞系的长期保存、实验的重复性、基因库的建立以及细胞治疗的储备等方面具有重要意义。通过冻存，可以有效减少细胞在传代过程中的遗传变异，并避免因污染、环境变化或实验操作失误导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是在细胞处于最佳生长速度时。

冷冻保护剂是细胞冻存中的关键成分，常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要作用是降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而保护细胞免受冰晶造成的机械损伤。DMSO是一种适用于大多数细胞类型的常用冷冻保护剂，但有些细胞对DMSO敏感，这时可以使用甘油作为替代品。

第一阶段：冷冻保存

实验步骤：

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型（以及任何其他有用信息，例如基因改造）。
2. 如果是贴壁细胞，先除去细胞培养基，用PBS清洗。接着添加适量的胰蛋白酶覆盖细胞，并在37°C培养箱中孵育约2分钟（具体孵育时间应根据实际培养的细胞类型调整）。然后添加等量的培养基以终止消化作用，用移液枪轻轻吹打细胞，将贴壁细胞冲洗下来，转移至50mL的Falcon管中。
3. 对于悬浮培养细胞，直接将所需体积的细胞转移至50mL的Falcon管中。
4. 使用血细胞计数器计数细胞以确定其活力，冻存的细胞活力应至少为75%。
5. 在室温下以300×g离心5分钟。
6. 准备冷冻培养基（见表1）。

表1：不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

细胞类型 | 冻存培养基配方
在含有FBS的培养基中培养的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜
在无血清培养基中培养的细胞 | 90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜
需要甘油冷冻的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%甘油

使用前需混合均匀，并加热至37°C。冷冻培养基应含有必要的冷冻保护剂，如DMSO，以防止形成可能损害细胞膜和成分的细胞内外冰晶。请注意，DMSO并不适用于所有细胞类型，在某些情况下可使用甘油替代。

7. 除去上清液。
8. 加入冻存培养基，使细胞达到所需的细胞密度。对于哺乳动物细胞，浓度通常为1×10⁶/mL冻存液。细胞在冻存液中室温放置的时间不应超过10分钟。
9. 将1mL样品分装到冷冻管中，盖紧盖子。
10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，并放入-80°C的冰箱。冷冻盒外周添加适量异丙醇，确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。缓慢的冷冻过程（每分钟-1°C）有助于防止细胞内冰晶的形成。
11. 约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管并转移到液氮中进行长期储存。通常，冷冻的细胞可以在液氮中保存数年。理想情况下，冻存细胞不应在-80°C下保存太长时间（最多一周），应尽快转移至液氮中，以免影响细胞活力。

第二阶段：解冻冷冻细胞系

实验步骤：

1. 从液氮储存器中取出冷冻管。快速将其放入37°C水浴中，解冻约80%（请勿在室温下解冻），整个过程不应超过1分钟。快速解冻是为了避免细胞受到损伤，同时尽快稀释和去除DMSO。
2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移至含约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。
3. 以300×g离心5分钟，弃去上清液，用适量培养基重悬细胞沉淀。
4. 将细胞悬液转移至培养容器中，然后放入37°C的培养箱中培养。

在细胞冻存和解冻过程中，我们推荐使用[人生就是博-尊龙凯时]等高品质的细胞培养基和冷冻保护剂，以确保细胞的生命力和功能在整个实验过程中的稳定性。通过合理的冻存和解冻流程，能够有效提升细胞的存活率，为后续的生物医学研究打下扎实基础。