### 产品及特点

本检测试剂盒是根据探针法荧光定量PCR原理开发而成，具有以下特点：

1. **即开即用**：用户只需提供样品DNA模板即可使用。
2. **高灵敏度**：经过优化的引物等组分，确保更高的检测灵敏度。
3. **阳性对照**：提供阳性对照，便于识别假阴性样品。
4. **高特异性**：引物设计基于中间普雷沃菌DNA序列的高度保守区，不会与其他生物样本的DNA发生交叉反应。
5. **定量与定性检测**：可用于定量和定性检测，定量检测的线性范围至少为5个数量级。
6. **使用量**：产品容量足以支持50次20μL的探针法荧光定量PCR反应。
7. **科研专用**：本产品仅限于科研使用。

### 方法步骤

#### 一、DNA提取

采取自选方法提取纯化样品DNA，本试剂盒与市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

#### 二、稀释标准曲线样品

为了避免交叉污染，阳性对照的稀释应在独立区域进行。
1. 标记6个离心管，分别为7、6、5、4、3、2号。
2. 每管加入45μL DEPC-H2O（推荐使用带芯枪头）。
3. 在7号管中加入5μL 阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），震荡1分钟，得到1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品，置于冰上备用。
4. 换枪头，在6号管中加入5μL（1×10⁷拷贝/μL的阳性对照），震荡1分钟，获得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品，置于冰上备用。
5. 重复上述步骤，直至获得6个稀释度样品。如不制作标准曲线，阳性对照可稀释至1×10⁵拷贝/μL。

#### 三、试剂配制

根据待检样品数量准备N+2个qPCR管（N为待检样品数量），分别加入试剂成分（详见说明书）。

#### 四、添加模板

向qPCR管中加入2μL模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品、婴儿利什曼虫qPCR阳性对照，离心30秒，随后立即进行扩增反应。

#### 五、扩增反应

将PCR管放置在PCR扩增仪器样品槽中，按照设定程序进行扩增（详见说明书）。

#### 六、结果分析

1. 若制作标准曲线，以阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴，绘制标准曲线，推算待测样品的DNA浓度。
2. 若未制作标准曲线，按以下标准判定：
- 阳性对照：Ct值<30，呈典型S型曲线。
- 阴性对照：Ct值为38或无Ct值。
- 样本结果：Ct值<35，阳性；Ct值38或无Ct值，阴性；Ct值在35-38范围内需复检。

### 运输及保存

产品需低温运输，保存于-20℃，有效期为一年。阳性对照应单独放置，避免与其他试剂交叉污染。
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