2025年4月,湖南师范大学的杨荣华教授和邹振副教授团队在《Nucleic Acids Research》(影响因子 = 167)上发表了一篇文章,题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”。该研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的新型SNV检测平台——HEPSD(高能量惩罚SNV检测平台),利用二元crRNA结构设计,激活Cas12a的切割活性,并通过非平衡杂交调节放大单核苷酸错配信号。
HEPSD在极端GC含量下,能够有效区分难以检测的SNV(例如摆动突变),并且与qPCR及二代测序(NGS)在临床样本的准确度高度一致,达到100%的准确率。这一平台的有效性证明了其在临床分子诊断中的巨大潜力,其设计理念也可扩展到其他CRISPR系统。
研究背景
单核苷酸位点变异(SNVs)是常见的遗传变异形式,与许多严重疾病(如癌症、单基因疾病及传染病)的发生密切相关。传统的SNV检测方法(如TaqMan探针、分子信标、ARMS-PCR等)对难检测的SNV(如摆动碱基对和高GC含量区域的SNV)效果不佳。尽管CRISPR-Cas系统(如Cas12a)在核酸检测领域具有革命性的意义,但在crRNA介导的识别过程中,Cas12a无法保证对所有单碱基错配的高特异性。
研究结果
1. RNA/DNA二元探针与热力学分析
二元探针(BPs)由两个杂交臂组成:一个长臂和一个短臂,专门设计用于通过选择性杂交来区分SNVs。研究发现,BPs在更广泛(ΔT 40℃)和更低的温度范围内更有效。进一步的系统评估表明,BPs在37°C下保持最佳活性。
2. 非平衡杂交驱动的高能量SNV检测系统
基于BP辅助Cas12a系统的激活性能,研究人员设计了二元CRISPR RNA(crRNA)结构,开发了HEPSD平台。分子动力学模拟及荧光各向异性分析显示,HEPSD在匹配目标中形成稳定的三元复合物,而在错配目标中则表现出动态不稳定性,有效抑制Cas12a的激活。这使得HEPSD在处理错配时,仅部分解旋DNA,从而避免了Cas12a的误激活。
3. HEPSD对难检测SNV的高效区分能力
在评估HEPSD对难以检测的SNV的能力时,发现其能够准确区分高GC含量区域突变和摆动碱基对的错配,具有高特异性,并且检测限低至0.01%的突变等位基因频率(VAF)。在进行凝胶电泳和实时荧光实验时,HEPSD对完全匹配目标保持了高效的切割活性,对错配目标几乎没有活动。
4. HEPSD分析BRAFV600E和EGFRL858R突变
为评估HEPSD在临床相关癌症突变的有效性,研究者选择了BRAFV600E和EGFRL858R作为靶突变对象。在对104例BRAFV600E及28例EGFRL858R的临床样本(包括组织和血浆)的测试中,HEPSD的敏感性和特异性均达100%,且与定量PCR(qPCR)和下一代测序(NGS)的结果高度一致。
结论与展望
本文介绍的HEPSD平台通过创新的二元crRNA架构和非平衡杂交驱动调控,显著放大了错配碱基的能量惩罚差异,实现了超高特异性识别。这一平台在检测难以识别的SNV方面表现出色,可精确区分传统方法难以检测的类型,并在复杂的GC含量区域保持优异性能。HEPSD平台在132个临床样本中的应用表明,其在临床分子诊断中具有重大的潜力,准确率达100%。总之,HEPSD提供了对SNV的高灵敏、高特异性检测,尤其是在难检测突变和临床样本中表现卓越,正如人生就是博-尊龙凯时所秉持的,不断创新、追求卓越,以推动生物医疗领域的进步。
本研究中所有DNA和RNA寡核苷酸的合成与纯化均由河马生物提供。河马生物提供精细的crRNA、tracrRNA、sgRNA及引物设计合成服务,修饰包括2′-F、2′-OMe、2′-MOE、LNA、PS、C16、VP、GalNA、胆固醇、FAM、CY3/CY5等。