在当代生命科学中，蛋白质的一级结构——即其氨基酸序列——已不再被视为静态的分子信息。它不仅决定了蛋白质的空间构象和功能特性，还深刻影响细胞行为、信号通路的动态变化，甚至演化路径与疾病机制。因此，准确获取蛋白质的序列成为理解其生物学功能和作用机制的基础。

与传统的“蛋白鉴定”不同，蛋白测序（Protein Sequencing）更关注完整且连续的氨基酸信息，其应用包括解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白的一致性或追踪翻译后修饰等关键科研任务。在生物药品开发、个性化医学、结构生物学和抗体工程等高精度领域，蛋白测序技术的精细化能力已成为研究和应用决策中的关键技术杠杆。

一、蛋白测序与蛋白鉴定的区别

在蛋白质组学研究中，术语“测序”和“鉴定”常被交替使用，容易导致误用和研究假设的混淆。蛋白测序指的是解析蛋白质氨基酸序列的过程，旨在重建其一级结构的连续排列，通常以N端到C端的方向表示全部或部分氨基酸序列，其目标在于获取“序列本体”，而非仅仅判断蛋白的“存在性”或“类别归属”。

相较而言，蛋白鉴定依赖质谱与数据库匹配，确定某一肽段是否“属于”某个已知蛋白，它是一种分类式的“归属判断”，而非逐位点的信息重建。

二、蛋白测序技术的演化

1. Edman降解：高精度线性识别的起步

Edman降解是20世纪50年代由Pehr Edman提出的首个蛋白质序列解析化学方法，其基于苯异硫氰酸（PITC）对N端氨基酸的特异反应，通过顺序标记与切除，每一轮释放并鉴定一个PTH-氨基酸，从而实现线性序列的重建。尽管此方法具有高识别精度和可控误差，但仅适用于具有游离N端的纯化样品，且序列长度通常不超过30-50个氨基酸，无法处理混合物或修饰蛋白。

2. Bottom-up质谱策略：高通量测序的核心

质谱技术的引入标志着蛋白测序发展的重要转折点。Bottom-up策略通过特异性酶解将蛋白质切割为短肽段，利用LC-MS/MS进行碎裂和检测，再借助数据库比对或de novo算法重建蛋白质序列。这种方法具有良好的通量和适配性，已成为最常用的蛋白测序方法。然而，由于其间接推导的特性，Bottom-up存在序列上下文信息缺失和识别歧义的问题。

3. Top-down质谱策略：整分子结构的深入解析

Top-down测序策略跳过酶解，直接将完整蛋白质送入高分辨率质谱分析。通过高能碎裂解析多级碎片离子，实现对蛋白质一级结构的分析。该方法特别适合蛋白质翻译后修饰识别和蛋白质质量属性评估。然而，高分子量蛋白碎片的解析难度、对质谱平台的要求，以及样本纯度的严格控制，都是Top-down战略面临的挑战。

4. 单分子蛋白测序的兴起

传统质谱测序策略主要基于肽段碎裂与谱图重建，存在一定的分辨歧义和修饰丢失的局限性。近年来，研究者开始探索不依赖酶解、能够直接读取氨基酸顺序的单分子测序技术。这类技术的核心理念是在保持蛋白整体结构的基础上，实现逐残基识别。

总而言之，尽管蛋白测序面临诸多挑战和局限性，各种技术路径——从化学降解到质谱分析，再到单分子水平的直接读取——构成了一个相互补充的信息获取体系，在不同的研究目标与样本条件下，提供了实现结构精确性、序列覆盖率和修饰还原度之间平衡的策略支持。

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